细胞培养资料

2012-02-16 00:00 来源:丁香园 作者:
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3、细胞凋亡:细胞的死亡是个体存活的正常现象,常见的细胞死亡形式有3种:坏死、凋亡和细胞毒性。多细胞生物的生命活动中,因为环境因素的突然变化或病原物的入侵,导致一部分细胞死去,称为细胞的病理死亡,或细胞坏死。坏死是细胞暴露于严重的物理或化学刺激时导致的细胞死亡;细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件,不依赖于其它两种细胞死亡机理,如杀伤T细胞的细胞毒性作用。

还有一种情况,一部分细胞的死亡是生物个体正常生命活动(代谢、生长、发育、分化)的一个必要部分;似乎带有“牺牲局部,保全整体”的意味。这种情况下的细胞死亡,明显地受遗传控制,称为细胞凋亡。 凋亡(Apoptosis)则是程序性的、正常的细胞死亡,是机体清除无用的或者不想要的细胞的手段。它与细胞坏死是两个截然不同的过程,无论从形态学、生物学还是生化的特征来说,都有明显的区别。细胞凋亡现象普遍存在于生物界。细胞凋亡与细胞增殖、分化和衰老起着互补与平衡的作用,在多细胞动物的发育、形态建成与维持中扮演至关重要的角色。作为细胞的一种基本生命现象,凋亡失控的结果将是可怕的:凋亡不足时,易发生癌变、病毒性疾病和自身免疫疾病;而凋亡过量则可能产生获得性免疫缺陷综合征(HIV)、重症肝炎与退行性神经疾病,如老年性痴呆症(Alzheimer's disease)、帕金森氏症(Parkinson's disease)。因此研究细胞凋亡及其机理具有重要的理论和实践意义。

细胞凋亡与坏死的区别

坏死 :

形态学特征-膜完整性丧失,胞浆和线粒体膨胀,全细胞裂解。

生化特征-离子内环境失调:非能量依赖性的(被动过程,在4°C也可以发生),随机消化DNA(电泳显示为DNA弥散状态),Postlytic DNA断裂。

生理学特征-影响群组细胞:由非生理学因素引起(如补体攻击、代谢中毒、缺氧等),被巨噬细胞吞噬,周围有明显的炎症反应。

凋亡 :

形态学特征-胞膜出芽,但保持完整,染色体聚集在核膜周边,胞浆收缩、细胞核凝集,最后细胞分裂为凋亡小体,Bcl-2家族蛋白导致线粒体膜通透性增加。

生化特征--ATP依赖性的(主动过程,在4°C不能发生),以核小体为单位剪切DNA(电泳显示为DNA ladder),Prelytic DNA 断裂,线粒体释放多种因子至胞浆中(细胞色素c、AIF),Caspases级联活化,膜对称性改变(PS外翻)

生理学特征--只影响单个细胞,由生理学刺激诱导(如生长因子缺乏、激素环境改变等),被临近细胞和巨噬细胞吞噬,无炎症反应。

第四节 细胞计数及活力测定

一、原理 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好,所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞,总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力,由组织中分离细胞一般也要检查活力,以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力,了解冻存和复苏的效果。

用台盼兰染细胞,死细胞着色,活细胞不着色,从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应,也可测定细胞相对数和相对活力。

二、仪器、用品与试剂

1、仪器与用品:普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪(或分光光度计)

2、试剂:0.4%台盼兰,0.5%四甲基偶氮唑盐(MTT)、酸化异丙醇

3、材料:细胞悬液

三、操作步骤

(一)细胞计数

1、将血球计数板及盖片用擦试干净,并将盖片盖在计数板上。

2、将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片和计数板之间。

3、静置3分钟。

4、镜下观察,计算计数板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算:

细胞数/ml=4大格细胞总数/ 4×10000

注意:镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团占10%以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液。

(二)细胞活力

1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。

2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液,染色2一3分钟。

3、吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片。

4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计细胞活力。

死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状。

活力测定可以和细胞计数合起来进行,但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

(三)MTT法测细胞相对数和相对活力

活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比,也与细胞活力呈正比。

l、细胞悬液以1000rpm离心10分钟,弃上清液。

2、沉淀加入0.5-1ml MTT,吹打成悬液。

3、37℃下保温2小时。

4、加入4—5 ml酸化异丙醇(定容)。打匀。

5、1000 rpm离心,取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色,酸化异丙醇调零点。

注意:MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。

第五节 细胞的分裂指数

一、原理:体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力,可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系,如随着分裂指数的不断提高,细胞也就进入了指数生长期。分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比,它是测定细胞周期的一个重要指标,也是不同实验研究选择细胞的重要依据。

二、仪器、用品与试剂

1、仪器与用品:CO2培养箱、普通显微镜、细胞培养血、盖玻片、吸管

2、试剂:培养液、胰酶、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液

三、操作步骤

1、消化细胞,将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。

2、CO2培养箱中培养48小时,使细胞长在盖片上。

3、取出盖片,按下列顺序操作:

PBS漂洗3分钟→甲醇:冰醋酸=3:1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。

4、盖片晾干后反扣在载玻片上,镜检。

5、计算:

分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%

四、注意事项;操作时动作要轻,以免使盖片上的细胞脱落。

第六节 细胞周期的测定

一、原理:细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。

单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法,但它不能代表细胞群体的周期,故现多采用其他方法测群体周期。测定细胞周期的方法很多,有同位素标记法、细胞计数法等,这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。

BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)加入培养基后,可做为细胞DNA复制的原料,经过两个细胞周期后,细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2,反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期,则染色体中约一半为两条单体均浅染,另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期,则两条单体均深染。计分裂相中各期比例,就可算出细胞周期的值。

二、仪器、用品与试剂

1、仪器、用品:同常规细胞培养

2、试剂:BrdU(1.0mg/ml),甲醇、冰醋酸,Giemsa染液,秋水仙素,2×SSC液

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编辑: 陈

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