利福平耐药对细菌生理学特征的影响
耐药结核分枝杆菌对公共卫生造成了严重的威胁。耐药的产生通常由于编码抗生素作用位点的基因发生突变。但是，通常认为耐药将造成「适应成本」（fitness cost），因此耐药菌株传播受限。
目前南非的研究发现，一些特殊的突变是否会影响结核分枝杆菌的重要生物学特征仍需要更多的证据支持。来自 Cape Town 大学的 Warner 教授等在 Emerging Microbes & Infections 发表文章回顾了结核分枝杆菌和重要的一线抗结核药物——利福平之间的关系，描述了耐药对各种细菌生理学特征产生影响的相关研究证据。
1. 为什么耐药？
利福平是重要的一线抗结核药物，对于缓慢生长的，甚至不复制的结核分枝杆菌均有抗菌活性。利福平的作用位点是 rpoB 基因编码的 DNA 依赖的 RNA 聚合酶（RNAP）的 β 亚单位。研究证明不同的细菌，绝大多数的利福平耐药突变发生于 Cluster I 的 81bp 区域（又称为利福平耐药决定区域，RRDR）。利福平结合口袋周围的 12 个氨基酸中，11 个与利福平耐药突变有关。通过分析临床分离到的耐药菌株发现，突变的结果通常是有大侧链的氨基酸替代了侧链较小的氨基酸，导致利福平不能够与 RNAP 结合，而失去作用。
图 1 利福平耐药基因突变相关位点
2. 利福平耐药的「适应成本」
一般来说，基本基因的耐药突变对重要的生理功能常有负面影响。即耐药导致「适应成本」：在没有药物选择压力下，没有耐药突变的菌株通常在不同的生长条件下均能够更好地完成生活周期。出于研究的可操作性及可解释性，目前大多数对于适应性的研究采用的是体外不同条件下的细菌生长曲线分析，但实际上在自然状态下大多数细菌不会遇到可以不受影响的指数生长环境。因此，我们可能需要更加合适的适应性研究模型。
实际上，生长速度仅仅是微生物「成功生存」的组成部分，因此适应性应该是微生物驱动生活周期的固有能力，反映了基因、生理学特征和能力的综合表现。对于像结核分枝杆菌这样的病原体来说，适应性则是造成感染、在宿主体内复制和持留，以及传播能力的总和。目前的一些观察性研究发现，一些作用较小的突变可能对导致耐药或者降低细菌获得性耐药成本有帮助，这些突变被称为「代偿突变」（compensatory mutations）。
Gagneux 等发现相当一部分利福平耐药的菌株同时携带有 rpoA 和 rpoC（分别编码 RNAPα 和 β 亚单位）突变，在利福平敏感菌株中则没有这些突变。研究发现引入 rpoA 和 rpoC 突变不能改变 rpoB 突变耐药株对利福平的敏感性，但是却显著增加了利福平敏感株的耐药。基于这些研究推测 rpoA 和 rpoC 突变可能是代偿性的。
3. rpoB 突变对细菌的生理学影响
耐药突变有可能改变细胞的功能。rpoB 作为固有的高度保守的细菌 RNAP 的组成部分，已经有数个研究证实了利福平耐药突变对细菌的生理学特征和代谢功能的影响。在结核分枝杆菌的研究中发现，随着培养基 pH 值的下降，rpoB 突变谱改变；暴露于利福平之后，包含 rpoB 突变的菌株氧氟沙星的 MIC 值升高；重要的细胞壁成份，如 phthiocerol dimycocerosates（PDIM）和脂肪酸前体发生改变等。
结核分枝杆菌与人体之间的相互作用是复杂和动态变化的。因此，大量资源投入用于阐明可能影响结核分枝杆菌感染进展的免疫通路和机制研究。但是，耐药对于宿主-病原体相互作用的影响仍所知甚少，这将是未来研究的重要领域。已经有研究检测耐多药结核病（MDR-TB）患者的外周血单个核细胞（PBMCs）对 PPD 刺激的反应减弱，前炎症因子、γ干扰素释放相比健康对照组降低；接受结核特异性抗原 ESAT-6 刺激后，γ干扰素和肿瘤坏死因子α的释放同样降低。
类似的，感染敏感菌株的结核病患者分离到的 PBMC 中，CD8+和 CD4+T 细胞经过刺激后均能产生γ干扰素和白介素 10，但是 MDR-TB 患者中分离到的 PBMC 中仅 CD8+T 细胞经抗原刺激后能产生细胞因子，提示 MDR-TB 患者中 CD4+T 细胞对抗原刺激的反应消失。这可能跟 MDR-TB 患者感染时间远远长于药物敏感的结核病患者，从而导致免疫受到抑制相关。
但是，究竟是免疫受损导致某些宿主感染耐药结核分枝杆菌，还是耐药相关的突变改变了结核分枝杆菌的生理学特征以至于病原-宿主反应受到影响？这个问题非常复杂，因为 MDR 菌株通常有不止一种耐药突变或者单核苷酸多样性。因此研究每个耐药突变（包括 rpoB 基因）对宿主免疫功能的影响非常重要。
Wrande 等研究发现在竞争性生长下某个 rpoB 等位基因的克隆性扩增与体外压力诱导利福平耐药可能相关。有研究发现不同利福平相关突变的菌株在生长速度上显著不同，rpoB 的单个氨基酸改变能够显著影响同种细菌的代谢。另外，一系列研究发现不同 rpoB 突变菌株对于体外压力的适应性不同。这些研究提示 rpoB 突变对细菌的代谢能力产生影响，而且在没有药物选择的情况下也可能出现。
图 2 影响利福平耐药菌株存活因相关因素
4. 未来研究方向
rpoB 突变与结核分枝杆菌的生理学和代谢功能相关，这对未来的研究提出了更多关键问题。例如 rpoB 等位基因是否影响了疾病病理过程？利福平相关突变是否能影响结核分枝杆菌传播和/或致病能力？其他药物靶点的突变（如 gyrA）也会影响细菌的生理过程吗？如果是，那么不同耐药突变的组合如何影响细菌存活？解决这些相关问题对于全面了解结核分枝杆菌利福平耐药基因和其他耐药基因至关重要。
编辑：阮巧玲
审阅：张舒
专家审稿：张颖，张文宏
本文经复旦大学附属华山医院感染科官方微信「华山感染」授权转载，未经作者同意禁止转载