给结核病诊断支招：新的诊断技术有哪些
结核病的疫情急需快速有效的诊断方法，但长久以来，结核病的诊断一直依靠传统的结核杆菌抗酸染色涂片和培养技术。但前者的灵敏度较差，部分患者无法提供标本。而后者耗时较长，并不能满足结核快速诊断的需要。近年来，新的结核病诊断技术和方法逐渐出现，为结核病诊断提供了新的思路。
目前结核病诊断方法分为如下几类
影像学技术及计算机辅助诊断技术
显微镜学诊断技术
结合分枝杆菌的快速培养技术
活动性结核病和潜伏性结核感染的免疫学诊断技术
核酸扩增检测方法/分子检测
在本篇中，我们将为大家介绍这其中较为具有代表性的技术。部分技术已经获得了 WHO 的推荐，部分技术则正在进行大规模临床研究或验证。我们将对每项技术逐一讨论，阐述近年来结核病诊断新的发展方向。
结核分枝杆菌的培养技术
结核分枝杆菌的培养仍然是结核菌检测和药敏试验（DST）的金标准。但传统的罗氏培养法耗时较长，约为 4~6 周，不能满足快速诊断的需要。液体培养系统如 BACTEC 和 MGIT（BD Diagnostics, Sparks, Maryland, USA）提供了较传统固体培养更为敏感和快速的方法，1~3 周即可检测到分枝杆菌的生长。
1. 分枝杆菌生长指示管法
分枝杆菌生长指示管法（mycobacterial growth indicator tube, MGIT）在管底含有荧光复合物，该荧光复合物可被氧气淬灭。当分枝杆菌生长时，管内氧气逐渐被消耗即可探测到管底的荧光复合物。
图 1 BD BACTEC™ MGIT™ 系统
优点
1）检测不到 8 天即可显示结果。
2）可对链霉素、异烟肼、利福平和乙胺丁醇进行药敏检测。
3）WHO 和结核战略技术顾问组推荐在有条件的地区逐步启用液体培养，包括低收入国家。
2. TK SLC L®结核杆菌快速培养系统
TK SLC L®结核杆菌快速培养系统也是一种改良的液体培养方法，通过液体培养基颜色的改变（红色变为黄色）可以检测到结核杆菌的早期扩增，并且可以区分真菌和其它革兰阴性杆菌的污染。TK SLC L®液体培养基在结核病诊断中的应用目前还在进一步评估和验证。
图 2 标准的 TK 培养基为红色（如左管），当检测到结核分枝杆菌感染后将变为黄色（如中管），若污染可变为绿色（如右管）。
优点
1）TK SLC L®将报告时间缩短 3~5 天。
2）TK SLC L®污染的几率较少。
分子诊断技术
1. Gene Xpert® MTB/RIF
结核杆菌的分子诊断技术近几年出现了突破，其标志就是以 Xpert 技术为代表的盒式诊断技术的出现。Xpert MTB/RIF 检测试剂盒为美国 Cepheid 公司开发的，适用于 GeneXpert 仪器，可以在 2 小时内直接时间从病人新鲜痰液或冻存痰液中检测是否还有结核分枝杆菌及对利福平的耐药性，整个过程都在一密闭环境中进行，手动操作时间不超过 5 分钟，对操作者和周围环境安全，全程约 2 h 即获得结果。
图 3 美国 Cepheid Gene Xpert® MTB/RIF 试剂盒
Xpert MTB/RIF 以半巢式实时定量 PCR 扩增技术为基础，能够自动抽提 DNA 并且扩增 rpoB 基因。由于 95% 以上的利福平耐药菌株都有 rpoB 基因变异，所以扩增 rpoB 基因同时可以鉴定是否为利福平耐药菌株。由于大部分利福平耐药的菌株同时对异烟肼耐药，所以 rpoB 基因的检测又可以在一定程度上判断是否为多耐药菌株（MDR-TB）。
图 4 Xpert MTB/RIF 检测试剂包含 3 对特异性引物，5 个探针， 检测 rpoB gene。
2010 年新英格兰杂志公布了一项多中心的研究结果，研究结果表明，以培养为参考标准，Xpert MTB/RIF 的灵敏度为 92.2%，特异度为 99.2%。近年来，Xpert MTB/RIF 技术已在多个国家和地区完成了诊断效果的研究和评估，其诊断疑似结核感染的敏感性为 88% (95% CI 83%~92%)，特异性为 98% (95% CI 97%~99%) 。
图 5 Xpert MTB/RIF 检测流程图
2010 年 12 月，WHO 首次发布官方文件推荐 Xpert MTB/RIF 技术的使用。随后截止至 2014 年 3 月，共有 104 个人国家，超过 2300 台 GeneXpert 检测仪器和超过 600 万个 Xpert MTB/RIF 的标本收集盒被采购。
图 6 截止到 2014 年末，GeneXpert 已累积生产了 17,883 组模块和 10,013,600 组标本盒，销往 145 个国家和地区。
2013 年，WHO 又再次发文更新了对 XpertMTB/RIF 的推荐意见：
当成人和儿童患者怀疑 MDR-TB 感染或合并 HIV 感染时，强烈推荐 Xpert MTB/RIF 作为首选检测方法，从而替代传统的涂片镜检，培养和药物试验的方法。
对疑似肺外结核患者的肺外标本如脑脊液，淋巴结和其它组织，推荐 Xpert MTB/RIF 作为检测方法。
对于痰涂片检测阴性的患者，推荐 Xpert MTB/RIF 作为后续检测方法。
2. 环介导的等温扩增技术
环介导的等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术是一种快速、简便并且有效的 DNA 扩增方法。TB-LAMP 技术采用结核杆菌特异性的引物，其结果采用荧光发光的可视化检测，对 DNA 的扩增不需要热循环仪器。
图 7 TB-LAMP 技术流程示意图。
TB-LAMP 技术采用结核杆菌特异性的引物，其结果采用荧光发光的可视化检测，实验全过程采用全封闭系统，从而减少工作场所 DNA 的污染，来保证检测的准确性。
图 8 荧光发光检测后，管 1，2，7，8 为阴性，管 3，4，5，6 为阳性。
目前 TB-LAMP 技术在 FIND 基金资助下正在开展大规模的临床研究，在 14 个国家或进行，并与 LED microscopy 和 Xpert MTB/RIF 方法进行了头对头的比较，其中在冈比亚的研究结果以于 2015 年 12 月发表，证实 TB-LAMP 诊断结核病总体的敏感性为 99%，特异性为 94%。
图 9 FIND 基金资助下正在开展大规模的临床研究。
显微镜学诊断技术
1. Ziehl-Neelsen 染色法
石炭酸复红抗酸染色涂片即为传统的 Ziehl－Neelsen 染色法，金胺-罗丹明染色也是临床中重要的结核杆菌检测方法。两种方法确诊肺结核的特异性高，快速简便，为 WHO 推荐的作为检测结核杆菌的广泛使用的方法。
2. LED 荧光显微镜
LED 荧光显微镜结合了 LED 光源与荧光显微镜，使用寿命长，价格相对于荧光显微镜更加低廉。WHO 于 2011 年发表官方文件推荐 LED 显微镜逐步取代传统的荧光显微镜，并可以作为以 Ziehl-Neelsen 染色为基础的传统光学显微镜检测的替代方法。
3. 全自动化读片系统 TBDx 系统
TBDx 系统是建立在荧光染色基础上的全自动化读片系统，荧光染色后的涂片标本可以放入 TBDx 系统，系统会自动读取并报告检验结果，每小时能处理 10~12 张，其诊断准确性与专业人员判断的结果无明显差异。
图 10 TBDX 由三部分构成，左上为 Automated Slide Sorter, 右上为 Microscope, 左下为 DigitalCamera and Computer System。
免疫学诊断技术
以细胞免疫反应为基础的γ干扰素释放试验如 T-SPOT 与 QuantiFERON-TB Gold 检测近年来获得了较快的发展被并广泛应用。但上述仍存在一定问题：诊断的敏感性仍有待提高，会出现无法判定结果的情况；无法区分活动性结核病和潜伏性结核感染；无法预测潜伏性感染者的活动风险等。新型试剂盒通过增加新的诊断抗原，诊断标志物等对该技术进行了改进。
图 11 IFN-γ释放实验（Interferon-γ release assay,IGRA) 检测的是结核杆菌抗原特异性记忆性 T 细胞，无法区分活动性结核和潜伏性结核感染
1. QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT®-Plus)
Qiagen 公司 2015 年底公布了新一代结核诊断试剂盒 QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT®-Plus) 。
QFT®-Plus 包含有四根采血管，管壁上分别包被有阳性对照、阴性对照和两个结核特异性抗原。与上一代产品相比较，新产品宣称第一次加入了 CD8+T 细胞应答的数据，可以对潜伏感染发展为活动的风险进行评估，并较现有 IGRAs 具有更高的敏感性（95.3%）和更高的特异性（97.6%）。目前，新一代试剂盒已获得欧盟市场认证（CE-IVD），但尚未通过美国 FDA 认证。
图 12 QFT®-Plus 包含四根采血管：阴性对照管，阳性对照管，TB 抗原管 1，TB 抗原管 2。
2. Determine TB LAM Ag 免疫检测试纸条
Determine TB LAM Ag（Alere, Waltham, MA, USA）免疫检测试纸条原理是以体液免疫反应为基础，从而监测尿液标本中的 LAM（脂阿拉伯甘露聚糖）抗原。LAM 是分枝杆菌细胞壁的组成成分，能够被肾小球滤过并能够在尿液中被检测出来，因而已被广泛用于结核感染的诊断抗原。检测时，直接将试剂条插入尿液标本，若检测到 LAM 抗原，则在试纸条上出现条带。
整个操作过程非常简便。
图 13 上图为 TB-LAM 的三根试纸条。试纸条上端白色区域若出现红色的条带为阳性对照，在三根试纸条中均可看到。而下端白色区域若出现红色的条带，则为抗原阳性。中间及右侧的试纸条均为阳性结果，左侧试纸条为阴性结果。
另一项在南非的描述性研究表明：Determine TB-LAM 检测在 CD4 细胞计数低的人群中具有较高的敏感性，在 CD4 细胞计数<50/ul 的病人中为 66.7%，在<100/ul 的病人中为 51.7%，在<200/ul 的病人中为 39.0%，特异性在各个人群中均高于 98%。当把 Determine TB-LAM 的结果与痰涂片结果联合的话，在 CD4 细胞计数<50/ul 的病人中敏感性为 72.2%。
与 Xpert MTB/RIF 检测相比较，敏感性无统计学差异。
优点
1）操作快速，检测全过程仅需 25 min。
2）费用低廉。
3）肺内和肺外结核均可检测。
4）在 HIV 感染的 CD4 细胞计数低的人群中具有较高的敏感性，可以作为对现有诊断方法的补充，与痰涂片方法联合，具有较高的诊断敏感性。但该技术在免疫功能正常的人群中的检测效能需进一步评估。
影像学及计算机辅助技术
胸片检查目前仍旧被 WHO 推荐用于结核疑似病人的筛查，特别是在低收入和条件受限制的地区。但近年来，新的影像学检查技术的诞生也进一步推动了结核影像学的发展。
数字化胸片（DR）及计算机辅助图像分析系统
这种软件由挪威的 Radboud 大学工作人员开发，称为 CAD4TB 系统，目前已经发展到第四代。 CAD4TB 为全自动的检测系统，主要工作流程是对胸片图像中的可疑病灶进行搜索，包括肺部阴影，肺形畸变和空洞等，然后与数据库中的图像进行比对和计算，最终得到是否肺结核的诊断。
图 14 左图为常规胸片检查，可见右上肺有一个病灶。右图为通过 CAD4TB 系统对胸片进行数字化分析，从而发现病灶。
优点
1）自动对图像进行分析，1 分钟之内就能获得诊断结果。
2）与人工读片相比较未见明显差异。
3）可建立移动式检查站点。
4）不需要专业人员，减少筛查成本。
总结
全球结核病的疫情急需快速简便的结核病免疫诊断技术，目前已有多种有潜力的新诊断方法获得了开发并进行了广泛的评估，其中有些检测方法如 Xpert 已经通过 WHO 的评估并获得了推荐，更多的方法已经在进行临床试验和评价。相信在不久的将来，新技术的应用将会使我们更快更迅速的发现结核感染，从而进一步为预防和治疗服务。
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编辑：Jingwen
审阅：王森，孙峰
专家审核：金嘉琳教授
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