准种（quasispecies）是由艾根（Eigen）首先提出用于描述同种生物遗传异质性的概念，它特指不同病毒种群间有一定基因序列差异即基因异质性（差异一般不超过核苷酸序列总长度2%～5%），但尚不构成病原体不同基因型或血清型的现象。自然状态下，准种通常由一种或几种主序列以及一系列变异序列组成，当选择压力平衡时可维持相对稳定。乙肝病毒（HBV）具有的准种特性可能是引起乙型肝炎慢性化和抗病毒治疗失败的一个非常重要的病毒学因素。HBV准种概念的提出，为全面认识HBV提供了新的角度，使人们对HBV存在状态的认识产生了两个重要的飞跃：从单一病毒到病毒群的飞跃以及由静态到动态变化的飞跃。
GS FLX 高通量测序方法原理示意图 GS FLX高通量测序是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶协同作用下，检测系统可将每一个三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号达到实时测定DNA序列之目的。该方法具有速度快、应用广、读取序列长、准确率高等优点，为准种的检测带来了革命性的突破。
HBV感染是全球面临的重大公共卫生问题，超过20亿人曾感染HBV，其中近4亿为慢性HBV感染者。慢性乙肝（CHB）是一种难治性疾病，α干扰素与核苷类似物（NA）抗病毒治疗是目前国际上公认的少数有效的治疗方法。
核苷类似物主要包括拉米夫定（LAM）、阿德福韦酯（ADV）、恩替卡韦（ETV）、替比夫定（LdT）、替诺福韦（TDF）等，该类药物具有抗病毒作用显著、口服方便、安全性好等特点，但长期使用容易产生耐药，限制了其临床应用。
耐药突变位点检测的局限性
耐药是指由于HBV对药物发生适应性突变，导致药物抑制病毒作用敏感度下降的现象。核苷类似物特异性地结合于HBV聚合酶的底物结合部位，影响病毒复制。如果HBV聚合酶区基因突变，将导致某些特定部位的氨基酸被置换，使之与药物的结合力下降，从而引起药物敏感性降低和耐药。
目前已知的常见耐药突变位点主要见于逆转录酶（RT）的A、B、C、D区。研究发现，LAM耐药主要是由rtM204V/I/S原发耐药突变以及rtL180M、rtV173L等继发补偿突变所致。LdT与LAM结构相似，其耐药突变也基本相似。ADV耐药主要与rtN236T或rtA181V原发耐药突变相关。ETV耐药突变则包括rtM204和rtL180两个LAM原发耐药突变位点以及rtT184、rtS202或rtM250的其中一个ETV原发耐药突变位点，rtI169位点突变可能是一个补偿突变。
目前，对于HBV耐药突变位点的检测已经应用于临床，特别是对已知的耐药突变位点的检测已成为临床指导用药的重要依据。一旦患者标本中检测到已知的耐药突变位点，就意味着耐药已经或即将发生。对医师而言，就要考虑调整用药方案，以期达到最佳治疗效果。
但在临床耐药出现以前，我们还不能准确预测哪类患者会对哪一种核苷类似物产生耐药，也不能准确预测什么时间会产生耐药。如何避免或延缓耐药发生是迫切需要解决的一个重要临床问题。
HBV准种现象日益受到关注
大量临床结果显示，不同患者对同一核苷类似物的反应性不一样，同一患者对不同核苷类似物反应也不同。越来越多的研究表明，核苷类似物的不同反应性与HBV存在准种现象有着密切的关系。
如果临床医生能够方便地获得患者血清中HBV的准种特点，又能清楚地了解不同准种的HBV对不同药物敏感性的差别，就可根据客观依据优化抗病毒治疗药物的选择和方案的制定，从而提高HBV感染者抗病毒治疗的疗效。
新型高速测序技术，如GSFLX测序法避免了以前克隆测序法的费时费力，为准种的大规模高通量检测提供了可能（见图）。
HBV准种特点对药物反应性和耐药性的影响
除了耐药位点，HBV准种的以下特征对药物反应性和耐药性也有不容忽视的影响，对其进行监测可更好地指导临床用药。
基线准种模式及比例
对于同一种核苷类似物，为什么有的准种耐药，有的准种敏感？不同准种药物反应性的差异是否由基线准种的模式所决定？有研究发现，LAM治疗患者发生病毒突破时几乎总表现为无野生株存在的YMDD耐药种群，无病毒突破时则表现为野生病毒种群或野生株与YMDD耐药株混合种群。
由此可见，从核苷类似物基因型耐药出现到发生病毒突破之间可能存在一个病毒种群转换时期，其中耐药株种群含量与比例可能是预测病毒突破的一个有价值指标，但还缺乏相关研究报告。
准种中劣势株的组成和比例分布
准种中存在着不同比例的优势株和劣势株，优势株和劣势株随着时间的推移和选择压力的作用会产生漂变。在药物选择压力下，不同病毒种群所占的相对比率重新调整。基线时的劣势株在核苷类似物的选择压力下，可能会转换成优势株。
我们与其他学者都观察到，临床上有些耐药病例并没有检测到已知耐药相关突变，但仍表现为临床耐药，排除宿主因素外，这种不典型耐药病例是否与基线时准种的组成，尤其是那些低频（例如<10%或<5%）的准种谱有关，值得进一步研究。
核苷类似物耐药突变的氨基酸替换形式复杂多样
研究表明，耐药突变的氨基酸替换形式可影响病毒的耐药性与复制能力，从而影响耐药株筛选。不同氨基酸替换形式耐药株在临床耐药和病毒突破中的作用不同。
不同的核苷类似物产生的耐药突变位点不一样，随着核苷类似物的长期使用，相信会不断发现新的更多的有潜在价值的突变位点。开展病毒种群大规模深度测序，不但可以找到已知突变位点，同时也可以发现新的突变位点，从而对某些氨基酸替换形式在病毒突破中的预测价值作出评估，加深对病毒耐药形成机制的认识。
核苷类似物耐药补偿突变位点与耐药的关系
对LAM的耐药研究表明，rtV173L、rtL180M等补偿突变和rtT128N、rtW153Q等疑似补偿突变在病毒突破时出现的几率明显增高。ETV耐药相关研究也发现，rtI169疑似补偿突变在病毒突破时出现几率明显增高。
原发耐药突变使病毒对药物敏感性下降，但通常病毒复制能力也随之下降，继续用药仍可以获得部分病毒抑制效果。继发补偿突变的筛选则可使耐药病毒株的复制能力部分或全部恢复，此时病毒DNA水平可能明显升高。因此，对耐药补偿位点的进一步检测和发现非常必要。
病毒准种复杂性和多样性可能与病毒耐药相关
病毒准种异质性越大，组成准种的病毒株就越复杂，其中包含的各种抵抗株可能就越多，其适应环境变化的能力就越强，临床上药物治疗的难度可能就越大。
有研究表明，反应性好和反应性差的患者准种复杂性和多样性的动力学改变在LAM治疗早期有不同的模式。治疗4周时准种动力学改变的复杂性和多样性与LAM抗病毒疗效及病毒耐药有关。
不同基因型、混合感染、重组体都与核苷类似物抗病毒反应有关
研究表明，不同基因型对核苷类似物反应性不一，不同基因型的混合感染和重组体都使核苷类似物抗病毒疗效更复杂，是否可将其作为监测指标还需大样本研究。
（重庆医科大学病毒性肝炎研究所 王瑜伟 黄爱龙 ）
