4. 基因表达和蛋白质相互作用
① 组织特异性基因表达
荧光素酶(luciferase)是一类生物发光酶，其中的renilla荧光素酶和firefly荧光素酶分别识别不同的底物, 一种细胞可被这两种荧光素酶标记: renilla 荧光素酶基因由一组成性稳定表达的启动子驱动, 作为内参，反应细胞数量的变化; firefly荧光素酶基因由要研究的组织特异性启动子驱动。这样firefly荧光素酶发光信号的变化，在消除细胞数量变化的影响后就可反应特定的启动子在动物体内的表达活性。
② 蛋白质相互作用
观察细胞中或活体动物体内两种蛋白质的相互作用，是将荧光素酶基因分成两段，分别连接所研究的两种蛋白之一的编码DNA，然后导入细胞或动物体内表达为融合蛋白。当两种蛋白有强相互作用时，表达的荧光素酶两部分相互靠近形成有活性的荧光素酶，在有底物存在时出现生物发光，反映出所研究的两种蛋白存在相互作用。应用此原理亦可用于研究细胞信号传导途径。
③ 阻断RNA
通过对比生物发光的变化，验证在成年小鼠体内，注射双链siRNA可以特异地阻遏基因表达。
5. 转基因动物模型
① 基因表达
为研究目的基因是在何时、何种刺激下表达，将荧光素酶基因插入目的基因启动子的下游，并稳定整合于实验动物染色体中，形成转基因动物模型。利用其表达产生的荧光素酶与底物作用产生生物发光，反应目的基因的表达情况，从而实现对目的基因的研究。可用于研究动物发育过程中特定基因的时空表达情况，观察药物诱导特定基因表达，以及其它生物学事件引起的相应基因表达或关闭。
② 各种疾病模型
研究者根据研究目的，将靶基因、靶细胞、病毒及细菌进行荧光素酶标记，同时转入动物体内形成所需的疾病模型，包括肿瘤、免疫系统疾病、感染疾病等等。可提供靶基因在体内的实时表达和对候选药物的准确反应，还可以用来评估候选药物和其它化合物的毒性。为药物在疾病中的作用机制及效用提供研究方法。
问答
小分子药物的标记用荧光与PET，哪一个更好？
小分子可以用荧光，也可以用放射性同位素标记进行相关的实验。但是由于荧光机团的大小与小分子药物差不多，用之标记小分子后，会影响小分子药物的特性，尤其是吸收、代谢方面。所以荧光标记小分子只是在不具备PET的使用条件后的一个替代方法，并不是最合适的方法。国外一般都是用PET标记小分子药物进行相关的研究。
为什么小动物CT不适合做肿瘤学研究？生物发光成像和小动物CT比较，有什么优势？
小动物CT适合做结构成像，对所观察标的的密度变化的敏感性很好，但是对于肿瘤细胞的活跃程度不敏感，如2005年1月JCI的一篇关于乳腺癌骨转移的文章里，详细比较了小动物CT与生物发光成像在观察骨转移方面灵敏度的不同。小动物CT要在接种16天以后，发生骨坏死，有溶骨现象，才能够观察到骨转移的存在，而生物发光成像在接种后第一天就观察到了骨转移现象。
体内可见光技术的发展过程是怎样的？
研究人员在1995年对此技术开始研究，技术在1999年才开始成熟，精诺真的商业产品在2000年出现在市场上。但大量的研究工作是在最近两年才开始的。技术开始流行起来，多数的文章也是在最近两年发表的。国内已经有四家单位购买了该系统进行相关的研究，有很多的科研工作者对这项技术产生了浓厚的兴趣，越来越多的人开始计划用该技术进行肿瘤学、流行病学、药物研究等。
相对于传统技术，生物发光成像技术的优势研究领域在哪里？没有优势的领域在哪里？
该技术是一项在某些领域有很大不可替代优势的技术，但是并不是万能的技术。因此，与传统技术相比，有它特别适合的领域，也有它不适合的领域。肿瘤转移研究，基因治疗，流行病学的发病学研究，干细胞示踪，白血病的相关研究等是该技术非常有优势的领域。在药物开发方面，用该技术进行肿瘤的药效研究，比传统方法更灵敏，还可以通过一系列转基因疾病动物模型，来快速直观的进行相关疾病的发病机理和药物筛选研究。
细胞凋亡的研究
PNAS(美国科学院院报)上发表的一篇文章介绍，可利用精诺真体内可见光成像技术直接观察活体动物体内的细胞凋亡。具体方法是：用分子生物学方法在荧光酶的两端连接上抑制其发光的蛋白(如雌激素)，但在其连接处加上CASPASE(细胞凋亡时特异表达的一种酶)的酶切点。细胞发生凋亡时，表达CASPASE，切开抑制荧光酶发光的蛋白，使荧光酶开始发光。
蛋白质与蛋白质的关系，如何研究？
PNAS(美国科学院院报)上发表的一篇文章介绍，可利用精诺真体内可见光成像技术研究活体动物体内蛋白与蛋白的相互作用。具体方法是：将分开时都不单独发光的荧光酶的C端和N端分别连接在两个不同的蛋白质上，若是这两个蛋白质之间有相互作用,，荧光酶的C端和N端就会被带到一起, 产生发光现象.。详细内容见文章。
成体小鼠可以看到体内发光吗？
可以。成体老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的区别只在与对可见光的穿透性不同，我们的技术可以看到成体正常老鼠的体内发光。这正是这项技术的价值所在。
荧光检测与生物发光检测的优势与劣势比较如何？
荧光发光需要激发光使得荧光基团达到较高的能量水平，然后发射出较长波长的发射光。两种常见的荧光蛋白：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein）和红色荧光蛋白或DsRed，这些蛋白荧光局限于可见光400-650nm范围。但生物体内很多物质在受到激发光激发后，也会发出荧光，产生的非特异性荧光会影响到检测灵敏度。特别是当发光细胞深藏于组织内部，则需要较高能量的激发光源，也就会产生很强的背景噪音。生物发光成像相对于荧光成像，其灵敏度高。作为体内报告源，生物发光较之荧光的优点之一为不需要激发光的激发, 它是以酶和底物的特异作用而发光, 且动物体自身不会发光，这样生物发光就具有极低的背景。虽然荧光信号远远强于生物发光，但极低的自发光水平使得生物发光的信噪比远高于荧光。另外, 生物发光信号可以方便计量，即便标记细胞在动物体内有复杂的定位，亦可从动物体表的信号水平直接得出发光细胞的数量。而对于荧光，信号水平取决于发光细胞的数量及激发光的强度，光线穿过的组织对其有强烈的吸收，这使得荧光强度很难计量。由于荧光素酶在表达后快速合成并具有较短的寿命，而成为环境条件快速变化（如感染疾病）的反应探针。可根据两者所具有的特点以及实验要求如组织的光学条件（报告源的深度、体积及组织吸光度等），选择所适合的发光探针。
有几种常用的荧光素酶？特性如何？
有两种常用的荧光素酶，luciferase 和 renilla的荧光素酶，二者的底物不一样，前者的底物是luciferin，后者的底物是coelentarizine 。二者的发光颜色不一样，前者所发的光波长在540-600nm，后者所发的光波长在460-540nm左右。前者所发的光更容易透过组织。后者在体内的代谢比前者快，但由于coelentarizine的原因，会有一些非特异性发光。所以，通常使用前者用作报告基因。
荧光素酶的发光特性如何？
荧光素腹腔注射老鼠后约一分钟后表达荧光素酶的细胞开始发光，十分钟后强度达到最高。在最高点持续约法20-30 分钟后开始衰落，约三小时后荧光素排除，发光全部消失。所以，最好的检测时间是在注射后15到25分钟之间。
荧光素酶的发光是否需要激发光？
荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素(LUCIFERIN)。荧光素是一种水溶性和脂溶性都非常好的小分子，很容易穿透细胞膜和血脑屏障。
如何保证荧光素酶(Luciferase)的稳定性？
荧光素酶基因是插到细胞染色体内的，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光酶也会得到持续稳定的表达。荧光素酶的半衰期约三个小时, 所以只有活细胞才能够持续表达荧光素酶。
标记的肿瘤接种以后，会发生luciferase的丢失吗？
从理论上会，但是还没有正式的报道。丢失的量，非常小，可以忽略不记，不会影响实验结果。当肿瘤传很多代长很大时，已经有很多细胞死亡，不具有观察的意义。
如何定量分析？
采取绝对光子数的计算方法，记录单位时间内、单位面积、单位角度接受到的光子数。这样，不同时间、不同仪器的测量结果可以进行比较，具有绝对的定量意义。每一个新标记的细胞株都要进行全面的定量分析才能用于定量实验，其中包括在体外和体内固定位置细胞发光的标准曲线。提供的每一种荧光酶标记的细胞株都做过精确全面的分析。我们也为客户免费提供这些分析的方法。
仪器的解析度如何？分辨率如何？
仪器的最高解析度在0.1毫米左右。最新的仪器IVIS 200的最高解析度可达到60um, 在体外可观察到单个发光细胞。由于可见光是漫射光，在体内走的路线不是直线，所以该仪器的体内光源的分辨率不是很好，通过该仪器观察的发光图片不能代表发光物质的结构信息，在动物体表所捕捉的发光信号只能代表发光的强度和大概的位置。小动物CT和MRI，在这方面具有优势，因为放射线走的路线很直。
发光的波长与体内的穿透性如何关系？
荧光素酶发出的光主要是偏红光，与绿色荧光蛋白(GFP)的绿色荧光不同。荧光素酶的偏红光比绿色荧光蛋白的绿光在体内的穿透性要强近一百倍。因为光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。血红蛋白（hemoglobin）是造成体内可见光被吸收的主要因素，其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。但是在可见光大于600纳米的红光波段，血红蛋白的吸收作用却很小。因此，在偏红光区域, 大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。
可以用荧光素酶基因标记干细胞吗？如何标记？
可以，标记干细胞有两种方法。一种是标记组成性表达的基因，做成转基因小鼠，干细胞就被标记了，从此小鼠的骨髓取出造血干细胞，移植到另外一只小鼠的骨髓内，可以用该技术示踪造血干细胞在体内的增殖和分化及迁徙到全身的过程。另外一种方法是用慢病毒标记干细胞。以上内容都有相关的文献报道。
