答疑结果：
问题一：
战友fsyqx：目前有没有真菌基因分型的有关检验方法？例如浅部真菌中的丝状真菌，除了形态学方面的诊断外，有没有更客观一点的指标？
战友zhaoxm777：我是一名危重病专业的医生。我们知道由于ICU患者的特殊性，使其成为侵袭性真菌感染的高发人群，且正成为导致ICU病人死亡的 重要原因之一。针对真菌的检测主要依靠形态学和免疫学等检查，如GM或G试验，但是对于相应检测真菌是否具有侵袭性或是侵袭强度却很难评定；我想请教目前 针对这方面，微生物基因诊断有新的进展或者相关发展思路吗？
战友zwq_096：目前深部真菌感染发病率及死亡率正逐年上升，尤其是在免疫缺陷患者。但常规传统的培养及活检方法不能早期得到诊断，这样就延误了该类 疾病的治疗，也就造成了高的死亡率。目前新型的诊断方法主要为血清学检测抗原抗体，分子生物学检测基因方法，但这些方法的实施仍存在很大的问题，如PCR 方法：标本类型的多样性；标本处理方法的不一致性；扩增针对靶点的不同， PCR反应类型的多样性；及结果评价的不一致性。所以造成这类方法的未被临床所推广应用，那么是否可以有这样一些组织，可以对该类方法进行一个一致性的评 估，进而能将该类方法推广到临床，以能缓解该类深部真菌感染的诊断及改善预后呢？
汤教授的答案：
这三个问题涉及真菌实验室诊断，我试着将其合并回答。
真菌感染诊断确实棘手，它有技术和临床两方面的原因：
1、技术本身：显微镜直接检查，抗原以及抗体检测灵敏度及特异性均不高，作为金标准的真菌培养费时且一些无菌标本（血、脑脊液等）中深部真菌培养灵敏度相当低。
2、临床联系：由于绝大多数真菌为条件性致病菌并广泛存在于环境及人体皮肤粘膜表面，非无菌标本中一般定性检查难以区别环境污染，“正常菌群”或感染。
目前趋势除了大力寻找高亲和性高特异性抗体用于真菌抗原快速检查外，采用定量PCR方法检测半无菌体液标本中特异性真菌载量可能有希望。另外现有人应用细 胞因子等宿主反应以确定所检测到的真菌是否有临床意义。上海中山医院呼吸科白春学主任和我业已开始这方面的合作，希望在一两年之内有些结果。
问题二：
战友nb1995703问：细菌存在保守区域，可以利用之进行公共引物的设计；请问病毒是否也存在这样的区域？不同的病毒（有的是RNA病毒，有的是DNA病毒）能否设计通用引物？谢谢！
汤教授的答案：
病毒不存在共同的保守基因区，但可以从下列方面试着进行“新”病毒的检测和寻找。
1、针对某一科（family）病毒的相对保守区（如DNA或RNA多聚酶基因）采用兼并（degenerate）引物放大全部可能的该科病毒，然后序列分析PCR产物。
2、采用差异显示技术（differential display technique）。
3、采用芯片技术对大批已知病毒进行检测鉴定。
4、采用随机PCR放大方法，在应用这种方法时，“未知”病毒的含量一定要大，所以一般用于病毒培养产物的鉴定。
问题三：
战友breezeface问：目前临床用于鉴定的方法还是生化鉴定为主，如果微生物基因诊断应用于临床，相对于生化鉴定来说，有什么优势和劣势呢？
汤教授的答案：
基因诊断用于微生物鉴定的主要优势是快速、客观。其缺点是除了价格较贵外，结果解释（比如99.2%核苷酸序列同源性的临床意义）上还有些问题。
问题四：
战友gong329问：9月份的感染病年会分会场您的讲座收益非浅，当时没来得及向您请教，对于病毒的基因诊断方面很感兴趣，请问：在实验室自己建立病毒 基因诊断方法时，一般阳性标本，以及标准品我们应该选用什么呢？特别是一些尚未建立良好体外培养模型的病毒（RNA病毒，DNA病毒），我们应该如何设立 阳性标本和标准品呢？谢谢汤教授！
汤教授的答案：
最好的阳性对照是合并（pooled）的多个临床检测阳性标本。此外，对于DNA靶基因，可以将PCR片段克隆到质粒中，将质粒掺入合并的临床检测阳性标 本中。另外，对于RNA靶基因，大量的特异RNA片段可以采用体外翻译的RNA或披甲（armored）RNA方法获得。
问题五：
战友zfx007：我对于微生物基因诊断在临床在临床微生物中的应用很感兴趣，请问：在乙型肝炎治疗过程中，主要的药物是核苷酸类似物，但耐药率发生率 高，严重影响医生对远期疗效的信心，也大大增加了患者的医疗费用，所以对耐药基因的检测已经有了很大的呼声，但HBV P基因YMDD变异的检测技术要么费用高、检测繁琐，无法普及，要么只能检测一种优势株，对于混合型感染通常不能识别，而且检测结果各地差异极大，没有相 对稳定的一种检测方法，请问汤一苇教授，目前有没有既敏感、特异、快捷又可以推广的HBV P基因YMDD变异的检测技术？
